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黄曲霉菌（Aspergillus flavus，AF）属子囊菌门、丛梗孢科、曲霉属，是一种常见的腐生型好氧真菌。AF易侵染多种粮食作物，如小麦、玉米、花生，不仅损害其品质，而且影响经济效益。二氢杨梅素（DMY）又名白蔹素、蛇葡萄素，属于二氢黄酮类化合物，多存在于葡萄科、杨梅科、杜鹃科、藤黄科、大戟科及柳科等植物中，其中在葡萄科藤茶中含量最高。以往研究表明，DMY具有广泛的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节血糖血脂、保肝护肝等，因此广泛应用于药品、食品、化妆品等行业。
作为一种天然植物提取物，DMY成本低廉、来源广泛，具有极大的开发前景。河南工业大学粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室的李 倩、赵 颖、谢岩黎*等先检测DMY对AF的抗真菌活性，在此基础上通过测定细胞壁/膜完整性、细胞内容物释放量、呼吸速率、细胞外相对电导率和pH值探究DMY潜在的抗真菌机制，最后评估其在粮食中的抑菌效果，以期为天然抑菌剂的开发提供理论依据。
1、DMY对AF孢子和菌丝的MIC
如图1A所示，DMY对AF孢子萌发有显著抑制作用。其中，0、0.5 mg/mL时，因DMY质量浓度过低，暂无抑制作用；当DMY为1 mg/mL时，24 h和48 h时抑制率分别为24.41%和9.05%；2 mg/mL的DMY处理48 h后80.45%的孢子未萌发；当DMY质量浓度不低于4 mg/mL时，孢子萌发抑制率达到100%，即DMY对AF孢子萌发的MIC为4 mg/mL。如图1B所示，DMY对AF菌丝生长同样有显著抑制作用。当DMY质量浓度为2 mg/mL时，24、48、72 h时菌丝生长抑制率分别为95.00%、29.88%和16.98%；当DMY质量浓度不低于4 mg/mL时，抑制率达到100%，即DMY对AF菌丝生长的MIC为4 mg/mL，高于香芹酮（MIC＝1.5 mg/mL）、槲皮素（MIC＝1.0 mg/mL）等，但低于罗勒烯（MIC＝8.0 mg/mL），这种差异可能与AF孢子及不同菌株浓度有关。
2、DMY处理后AF孢子存活率和菌丝生物量
如图2A所示，对照组孢子存活率接近100%，而4、8、16 mg/mL的DMY处理组中孢子活力下降，孢子存活率分别为80%、65%和65%，表明DMY处理从一定程度上削弱了孢子的活力，且呈现剂量依赖关系。此外，进一步对菌丝的生物量进行量化分析，如图2B所示，对照组振荡培养24 h的菌丝生物量为4.95 mg，对照组振荡培养48 h菌丝生物量达57.65 mg。与对照组振荡培养48 h相比，经2 mg/mL的DMY处理后，菌丝生物量显著下降，下降比例为55.51%，4 mg/mL的DMY对菌丝生物量的降低效果最为显著，下降比例为88.93%。同时，0-24组和4-48组的菌丝生物量无显著差异（P＞0.05），由此可知，4 mg/mL的DMY几乎能够完全抑制菌丝的生长。
3、细胞壁完整性观察结果
由图3可知，对照组菌丝隔膜完整且清晰透亮，表明几丁质含量较高。与对照组相比，1/2 MIC和MIC组隔膜数量依次减少，荧光强度依次减弱，表明DMY处理后，AF菌丝中几丁质含量减少，即细胞壁完整性被破坏。相似地，植物源天然化合物中的邻香兰素、HMB、丹皮酚等均能不同程度的溶解隔膜，在具有相似隔膜的酸腐菌中也发现，肉桂醛能够溶解隔膜，植物精油如紫苏精油能够从基因水平调控葡聚糖合成酶、几丁质酶等的表达。以上研究表明，细胞壁可能是植物源天然化合物抑菌的一个靶标，然而，哪些天然化合物能够被成功开发为靶向抑菌剂仍有待进一步研究。
4、细胞膜完整性与细胞内容物释放量变化
结果如图4A所示。随着DMY质量浓度的增加，相对荧光强度显著增加，1/2 MIC和MIC组分别是对照组的36.49 倍和257.69 倍。结果表明，DMY破坏了AF真菌细胞膜完整性，且这种破坏作用与DMY质量浓度成正比关系。已有许多研究报道醛类化合物具有疏水性，能够破坏细胞膜，导致细胞膜的通透性升高、完整性破坏。
结果如图4B所示。当DMY质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC时，OD260 nm依次增加（分别为0.14、0.58和0.97）。与对照组相比，1/2 MIC组和MIC组光密度值分别增加了3.14 倍和5.93 倍。细胞内容物释放量的显著增加再次印证了细胞膜通透性的提高。
5、AF的相对电导率和pH值改变情况
如图5A所示，对照组和DMY处理组均呈现了相对电导率升高的趋势。对照组的升高可能是细胞内外的渗透压导致的，1/2 MIC组的升高趋势和对照组接近，在180 min时约为43%，MIC组的升高最为显著，180 min时约为69.63%。这些结果表明细胞内的导电物质穿过完整性遭到破坏的细胞膜，且随着时间的延长，渗出的电解质逐渐增多。上述PI染色、OD260 nm及相对电导率的检测结果均间接表明了DMY处理后细胞膜受到了损伤，且该损伤呈现剂量依赖关系。
如图5B所示，与对照组相比，DMY处理组细胞外pH值均升高，但随着时间变化，各组pH值均呈现略微下降的趋势，这可能与酸性物质的渗出有关。在180 min检测时间内，DMY处理组的pH值均明显高于对照组，推测处理组中有更多碱性物质渗出。
6、DMY对AF呼吸代谢的影响
如图6所示，与对照组相比，DMY对AF的呼吸抑制率呈现剂量依赖关系，1/2 MIC和MIC组的呼吸抑制率分别为16.99%和25.82%。已有研究报道部分植物源天然化合物对真菌的呼吸代谢有抑制作用，如柠檬醛在MIC时抑制率达到21.20%，HMB在MIC时的抑制率达到33.33%，癸醛在MIC时抑制率达到58.94%。
7、DMY对花生和玉米籽粒体外抑菌作用
AF的生长情况如图7所示，培养24 h时，除了两个MIC组，剩余花生和玉米籽粒上均观察到孢子的萌发。培养48 h时，对照组花生和玉米籽粒上均可观察到AF菌丝。培养72 h时，即便花生和玉米籽粒表面涂布有1/2 MIC的DMY，AF的生长情况也和48 h的对照组相似，而涂布MIC的DMY后花生和玉米籽粒表面则均无孢子萌发。
对图7污染情况的量化结果如图8所示，培养72 h时，花生和玉米籽粒AF抑制率达到100%的均为DMY的MIC处理组。与培养液抑菌结果相同，4 mg/mL的DMY能够完全抑制AF侵染花生和玉米籽粒，因此，DMY具有开发为新型抑菌剂的潜力。
结 论
本实验旨在研究DMY对AF的抗真菌效果及其作用机理，首先进行AF孢子萌发和菌丝生长的最小抑菌实验，然后通过CW和PI染色、细胞内容物释放以及细胞外pH值和相对电导率变化检测细胞壁和细胞膜完整性，并进行呼吸速率检测及花生和玉米籽粒体外抑菌实验。研究获得的初步结论如下：DMY对AF孢子萌发和菌丝生长的MIC均为4 mg/mL，其通过破坏细胞壁和细胞膜的完整性发挥抑菌作用。DMY处理后线粒体是否遭到破坏仍需进一步的实验证明。此外，DMY能够有效抑制AF侵染花生和玉米籽粒，未来有望将其开发为新型抑菌剂应用于粮食及农产品的储藏。
本文《二氢杨梅素抑制黄曲霉菌生长的机制》来源于《食品科学》2022年43卷13期8-14页，作者：李倩，赵颖，乔苏瑞，谢岩黎。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210628-324。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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